整合血浆和粪便代谢组学可识别腺瘤-结直肠癌进展中的功能性代谢物，并作为早期诊断生物标志物
Integrative plasma and fecal metabolomics identify functional metabolites in adenoma-colorectal cancer progression and as diagnostic biomarkers
标题：Integrative plasma and fecal metabolomics identify functional metabolites in adenoma-colorectal cancer progression and as diagnostic biomarkers
中文标题：整合血浆和粪便代谢组学可识别腺瘤-结直肠癌进展中的功能性代谢物，并作为早期诊断生物标志物
展开剩余93%期刊：Cancer Cell
影响因子：48.8
发表时间：2024.08
DOI：10.1016/j.ccell.2024.07.005
摘要
微生物代谢物与结直肠癌 (CRC) 密切相关，结直肠癌是最常见的癌症类型之一，也是全球癌症死亡的主要原因。然而，目前尚不清楚粪便和血液代谢物在腺瘤-癌进展中是如何改变的。本研究收集了1,251名个体的血浆和粪便样本。（422个结直肠癌（CRC），399个结直肠腺瘤（CRA），和430个正常对照（NC））。通过代谢组学分析，我们鉴定出了在NC、CRA和CRC中变化一致的特征性血浆和粪便代谢物，其中包括在CRC中富集的油酸和减少的别胆酸。油酸在CRC细胞、患者来源的类器官以及小鼠CRC模型中展现出促肿瘤生成的作用，而别胆酸则具有相反的作用。通过综合分析，我们发现油酸或别胆酸分别直接结合CRC细胞中的α-烯醇酶或法尼醇X受体-1，从而调节与癌症相关的通路。在临床上，我们建立了一个包含17种血浆代谢物的诊断小组，该小组在一个发现队列和三个验证队列中都能准确诊断CRC。总体而言，我们鉴定了CRC中血浆和粪便代谢组的代谢物特征、机制意义和诊断潜力。
结果
1.结直肠癌进展阶段血浆代谢物的改变
为了研究CRC的代谢组学特征，我们在发现队列中收集了373份血浆样本（包括119名CRC患者、143名CRA患者和111名NC）并进行LC-MS分析（图1）。在去除食物来源和外源代谢物后，鉴定出1026种内源性代谢物。PLS-DA和OPLS-DA分析表明，CRC、CRA和NC的血浆代谢组存在显著差异（图2A）。
为了表征结直肠癌进展各阶段中血浆代谢物的变化，我们进行了两两比较，以鉴定在不同组间具有显著差异且MS2评分>0.8的代谢物。实验揭示了NC、CRA和CRC中变化一致的血浆差异代谢物，其中22种代谢物沿着腺瘤-癌进展依次富集，包括犬尿氨酸、二氢胸腺嘧啶和多种脂肪酸（如油酸）（图2B、2C）。我们还观察到，在CRA和CRC中，包括别胆酸、L-组氨酸和脱氢表雄酮（DHEA）硫酸盐在内的34种代谢物依次减少。
图1. 工作流程示意图
2.结直肠癌进展阶段粪便代谢物的改变
除血浆代谢物外，我们还收集了373份粪便样本，并进行LC-MS分析。分析显示，CRC、CRA和NC之间的粪便代谢组存在显著差异（图2D）。
接下来，我们通过两两比较鉴定了CRC进展各阶段中显著变化的粪便代谢物。我们在NC、CRA和CRC中发现了不同的粪便代谢物，其中4种代谢物沿着腺瘤-癌进展依次富集，包括花生四烯酸、FAHFA等（图2E）。我们还观察到，在CRA和CRC中，包括迷迭香酸、香草酸在内的28种代谢物依次减少。总之，我们的代谢组学分析鉴定出了与CRC进展不同阶段相关的特征性血浆和粪便代谢物。
3.与化疗反应相关的微生物代谢物的改变
我们评估了72名接受化疗的CRC患者（包括43名应答者和29名非应答者）的代谢物与治疗反应之间的相关性。发现应答者与非应答者的血浆代谢组存在显著差异（图2F）。在应答者中，发现了雄甾酮硫酸盐、L-组氨酸和脱氢表雄酮硫酸盐的富集，以及促肿瘤生成的犬尿氨酸、氧化三甲胺和甘氨鹅脱氧胆酸的减少（图2G）。此外，在调整临床参数后，一组包含19种血浆代谢物的指标能够区分化疗应答者与非应答者，受试者工作特征曲线下面积（AUC）为90.8%（图2H）。其中包括5种在应答者中富集的代谢物和14种在应答者中减少的代谢物。这些发现暗示了微生物代谢物对CRC化疗反应的影响。
图2. 结直肠癌进展阶段中微生物代谢物的变化
4.微生物代谢物在结直肠癌进展阶段的相关性及功能作用
为了深入了解CRC中代谢物改变的功能意义，我们进行了代谢物集富集分析。与NC相比，CRC血浆代谢组中前3个差异途径分别是(1)亚麻酸和亚油酸代谢，(2)组氨酸代谢和(3)同型半胱氨酸降解（图3A）。CRC粪便代谢组中前3个差异途径分别是(1)组氨酸代谢、(2)丙氨酸代谢和(3)葡萄糖-丙氨酸循环（图3B)。然后评估CRC与NC相比代谢物与代谢通路的相关网络。我们的分析显示，CRC血浆（图3C）和粪便（图3D）代谢组中的差异代谢物主要与脂质代谢相关，这些脂质代谢物与其他代谢物和代谢途径形成分离的簇。此外，脂质代谢中的油酸和组氨酸代谢中的l-组氨酸位于相关网络的中心，提示它们在结直肠癌进展过程中在血浆和粪便代谢组中具有重要意义。
采用Spearman相关性研究CRC进展阶段对应血浆和粪便代谢物之间的相关性。我们发现了包括1,7-二甲基尿酸、L-尿胆素等在内的9个血浆和粪便代谢组之间显著相关的代谢物。（图3E)。我们还注意到，与NC相比，CRC的血浆和粪便代谢物很少重叠，血浆和粪便代谢组之间的多种代谢途径也发生了不一致的改变。这些发现暗示了CRC进展中血浆和粪便代谢组之间的明显变化。
5.结直肠癌中微生物代谢物与肠道微生物的相关性
为了分析肠道微生物群，我们对来自发现队列的粪便样本进行了宏基因组测序。从NC到CRA，再到CRC，肠道微生物的α多样性显著降低（图3F）。在物种水平上，与CRC相关的致病共生菌——微小帕尔维菌、具核梭杆菌和肽链球菌属在NC-腺瘤-癌进展中持续富集，而毛螺菌科细菌、罗斯拜瑞氏菌属和粪杆菌属的等有益菌持续减少（图3G）。
随后，我们检测了CRC中差异代谢物与肠道微生物之间的相关性。分析发现，CRC中血浆和粪便中富集的代谢物与微生物呈正相关。（图3H）。在血浆代谢物中，包括油酸在内的脂肪酸与CRC富集微生物的正相关关系最为显著。另一方面，F.naclatum与所有富集CRC的血浆代谢物呈显著正相关（图3H）。
图3.微生物代谢物在结直肠癌进展阶段中的相关性和功能作用
6.结直肠癌患者血浆代谢物与血清细胞因子的相关性研究
鉴于炎症是CRC进展的标志，我们通过对来自发现队列的80个血清样本（29个CRC、29个CRA和22个NC）进行细胞因子分析。分析发现，促炎细胞因子与CRC富集的代谢物呈正相关，或与CRC减少的代谢物呈负相关（图3I）。相反，抗炎的IL-4和IL- 13与CRC富集的代谢物呈负相关。
7.关键CRC-相关代谢物的体外功能验证
为了验证计算机模拟的发现，我们用CRC中富集程度最高的几种代谢产物（包括油酸和二氢胸腺嘧啶，见图2C）处理人结直肠癌细胞系（HCT116、HT29和DLD-1）。油酸（50 mM）显著促进了CRC细胞的活力并减少了细胞凋亡（图4A、4B）。它还导致处于S期的CRC细胞显著增加，同时处于G1期的细胞相应减少（图4C）。此外，油酸处理后CRC细胞的增殖明显增强（图4D）。我们进一步用油酸培养CRC患者来源的类器官（PDOs），并观察到处理后类器官的生长增加（图4E）。对于二氢胸腺嘧啶，尽管它也能促进结直肠癌细胞的生长和存活，但其促肿瘤生成的作用不如油酸显著。
我们采用了相同的体外生物功能试验来检测CRC中减少程度最高的几种代谢产物对人CRC细胞的影响（包括异胆酸和L-组氨酸）。异胆酸（500 mM）显著降低了CRC细胞的活力（图4F）并促进了细胞凋亡（图4G）。它还诱导了CRC细胞的细胞周期阻滞并显著限制了其增殖（图4H、4I）。此外，异胆酸显著抑制了CRC患者来源的类器官（PDOs）的生长（图4J）。L-组氨酸也对结直肠癌细胞的生长和存活表现出了较强的抗肿瘤作用，但作用显著性低于异胆酸。
图4. 关键CRC相关代谢物的体外功能验证
8.小鼠CRC肿瘤发生中关键代谢物的功能验证
我们采用致癌物偶氮甲烷（AOM）联合葡聚糖硫酸钠（DSS）建立了CRC小鼠肿瘤发生模型，并通过灌胃给予这些小鼠富含CRC的油酸或对照（图5A）。在结肠镜检查下，观察到接受油酸治疗的小鼠结肠肿瘤在视觉上比对照组的更大。经过6周的治疗后，处死小鼠，我们发现油酸显著增加了结肠肿瘤的大小和肿瘤负荷，与对照组相比均有统计学差异（图5B）。组织学评估证实了小鼠结肠肿瘤的发生（图5C），并且油酸治疗显著增加了增殖细胞的比例（图5D）。
我们还向AOM/DSS诱导的CRC小鼠模型中补充了CRC耗竭产物异胆酸（图5E）。肠镜检查发现，接受异胆酸治疗的小鼠结肠肿瘤数量较少。处死后，与对照组相比，异胆酸治疗的小鼠肿瘤体积显著减小，肿瘤负荷也显著降低图5F）。异胆酸治疗还显著降低了增殖细胞的比例（图5G、5H）。异胆酸治疗对血清ALT、AST和BUN水平无显著影响，表明我们使用的剂量（10 mM）是无毒的。
为了验证这一结果，我们建立了ApcMin/+CRC肿瘤发生模型，并给这些小鼠补充了异胆酸（图5I）。在结肠镜检查下，观察到接受异胆酸治疗的小鼠结肠肿瘤数量较少。与在AOM/DSS处理的小鼠中得到的结果一致，与对照组相比，异胆酸显著减小了ApcMin/+小鼠的肿瘤大小和肿瘤负荷（图5J）。通过组织学检查确认了结肠肿瘤的发生（图5K），并且异胆酸治疗降低了增殖细胞的比例（图5L）。
图5. CRC小鼠模型中关键代谢物的功能验证
9.CRC关键代谢物结合受体的鉴定
为了了解代谢产物如何与肿瘤细胞相互作用，我们对有或无代谢产物处理的人CRC细胞进行了LiP-MS分析。在CRC细胞中，我们鉴定了241个可能与油酸结合的蛋白质肽段，其中差异最显著的肽段是α-烯醇酶（ENO1）（图6A）。分子对接分析显示，油酸通过烷基相互作用与ENO1的Arg49残基结合（图6B），解离常数为10.6 mM（图6C）。为了验证ENO1在油酸诱导的CRC中的功能作用，我们在人CRC细胞（HCT116和HT-29）中沉默了ENO1，显示ENO1-siRNA在这两种细胞系中均消除了油酸的促瘤性效应（图6D）。同样，ENO1拮抗剂AP-III-a4逆转了油酸诱导的细胞活力增加（图6E）。这些结果证实了ENO1是CRC细胞中油酸的受体。
然后，我们在异胆酸处理的CRC细胞上进行了LiP-MS分析，发现差异最显著的肽段是FXR1（图6F）。分子对接分析表明，异胆酸通过氢键与FXR1的Arg70残基结合（图6G），解离常数为32.9 mM（图6H）。通过CRISPR-Cas9或RNA干扰使人CRC细胞（HCT116、HT-29）中的FXR1沉默后，异胆酸显著失去了其抗肿瘤作用（图6I）。异胆酸的保护作用也被FXR1拮抗剂甘氨胆酸抵消（图6J）。此外，FXR1 sgRNA（图6K）或FXR1拮抗剂（图6L）均逆转了由异胆酸引起的细胞增殖减少。与体外观察结果一致，与仅接受别嘌酸的小鼠相比，与FXR1拮抗剂联合治疗可消除别嘌酸酯的保护作用，这可以从肿瘤生长（p<0.0001）和肿瘤重量（p<0.01）的显著增加中得到证明（图6M）。因此，这些发现暗示异胆酸对CRC的保护作用取决于FXR1。
图6. 结直肠癌中关键代谢物结合受体的鉴定
10.识别结直肠癌中关键代谢物改变的信号通路
为了揭示其潜在机制，我们对有或无代谢产物处理的人CRC细胞进行了RNA测序。与对照组相比，在油酸处理的细胞中鉴定了127个上调基因和135个下调基因。途径分析显示，PI3K/Akt是油酸诱导的最富集的途径（图7A）。同样，油酸增加了人CRC细胞（HCT116、HT-29）中磷酸化JAK1、PI3K和AKT的蛋白质表达，而这种上调被ENO1-siRNA或ENO1拮抗剂AP-III-a4所逆转（图7B）。在补充了油酸的AOM/DSS处理的小鼠结肠肿瘤组织中，PI3K/Akt途径标志物的蛋白质表达增加得到了确认（图7C）。这些发现表明，油酸在CRC细胞中与ENO1结合以激活致癌性PI3K/Akt信号通路。
另一方面，与对照组相比，异胆酸处理导致人CRC细胞中36个基因显著上调，141个基因显著下调。MAPK是异胆酸诱导的最主要受抑制的信号通路（图7D）。异胆酸显著降低了人结直肠癌细胞（HCT116、HT-29）中MAPK通路标志物的蛋白表达，以及细胞增殖（PCNA）和细胞周期（Cyclin D1）标志物的蛋白表达，而这种下调作用可被FXR1-sgRNA、FXR1拮抗剂甘氨胆酸（图7E）或FXR1-siRNA所逆转。在补充了异胆酸的AOM/DSS处理的小鼠的结肠肿瘤组织中，这些MAPK通路的蛋白标志物也同样呈现下调（图7F），这表明异胆酸与FXR1的结合导致结直肠癌中MAPK信号通路的失活。
图7. CRC中关键代谢物改变的信号通路的识别
11.血浆代谢物在结直肠癌诊断中的表现优于粪便代谢物
接下来，我们在排除临床信息不足的样本后，研究了代谢物作为CRC和CRA诊断生物标志物在发现队列中的应用。利用识别出的差异血浆代谢物，我们建立了多个机器学习模型和逻辑回归模型，用于区分CRC患者和NC个体。在调整了年龄、性别、体重指数（BMI）和肿瘤位置等临床参数后，17个血浆代谢物生物标志物(7种上调代谢物，10种下调代谢物)在区分CRC和NC方面表现良好，LASSO模型的AUC为0.927（图8A）。这17种血浆代谢物在随机森林模型中也表现出较高的AUC值，为0.891，而逻辑回归模型中AUC为0.846。
同样地，我们利用差异粪便代谢物对结CRC和NC个体进行分类。在调整临床参数后，19种粪便代谢物生物标志物能够通过LASSO模型以0.916的AUC区分CRC和NC。随后，我们采用随机森林或逻辑回归模型对这19种粪便代谢物进行了评估，其AUC分别为0.839和0.800。通过比较所有模型的AUC，我们发现血浆代谢物在区分CRC和NC方面的整体性能优于粪便代谢物。结果表明，作为CRC诊断生物标志物，血浆代谢物比粪便代谢物更准确。
12.血浆代谢物面板作为不同结直肠癌分期的诊断生物标志物
我们评估了17种血浆代谢物生物标志物在不同CRC分期分类中的性能。该小组在区分早期CRC（I/II期）和NC方面的AUC为0.958（图8A）。此外，该小组在区分CRC和CRA方面也表现出色，AUC为0.928。随后，我们将该小组的性能与CRC的临床诊断标志物进行了比较，结果显示，与FIT或血清标志物相比，血浆代谢物在区分CRC和NC方面的性能显著更优。这些发现表明，血浆代谢物在CRC早期检测方面具有良好前景，其性能优于临床标志物。
13.血浆代谢物面板在三个独立队列中进行CRC诊断的验证
我们建立了一个独立的验证队列（验证队列1）来验证17种血浆代谢物的性能（图1）。在验证队列1中，该小组在区分CRC和NC方面的AUC为0.987，在区分早期CRC（I/II期）和NC方面的AUC为0.988（图8B）。此外，该小组在区分CRC和CRA方面的也表现出色，AUC为0.869。
该代谢物小组在验证队列2中也表现出色，区分CRC和NC的AUC为0.848，区分早期CRC（I/II期）和NC的AUC为0.860（图8C）。区分CRC和CRA的AUC为0.861。
为了确保地区差异对结果没有影响，我们从另一个独立地区建立了一个验证队列（验证队列3），以检验17种血浆代谢物的性能。在验证队列3中，该小组区分CRC和NC的AUC为0.909，区分早期CRC（I/II期）和NC的AUC为0.920（图8D）。区分CRC和CRA的AUC为0.928。发现队列和三个验证队列之间的一致结果证实了17种血浆代谢物生物标志物在结直肠癌诊断中的性能。
图8. 血浆代谢物作为不同CRC分期的诊断生物标志物
14.血浆代谢物面板作为CRA的诊断性生物标志物
我们进一步评估了由17种血浆代谢物组成的小组在发现队列和三个验证队列中对于CRA疾病的诊断性能。发现17种血浆代谢物生物标志物在CRA诊断中的前景也十分广阔。
结论
综上所述，我们在大样本队列中全面阐述了CRC进展的代谢组学特征，并鉴定了在NC、CRA和CRC患者的血浆和粪便代谢组中显著改变的代谢产物。随后的体外生物功能实验和体内CRC肿瘤发生模型证实了它们在结直肠癌进展中的功能重要性，而机制研究则确定了它们在肿瘤细胞中的相应受体和下游信号通路。在临床上，我们建立了一个血浆代谢物诊断小组，其能够以高灵敏度和高特异性准确区分CRA患者和早期CRC患者，并通过靶向代谢组学和三个独立验证队列进行了确认。综上所述，我们的研究结果突出了代谢产物在结直肠癌进展中的关键作用，以及血浆代谢产物作为结直肠癌患者非侵入性早期诊断生物标志物的广阔前景。
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